1.

Doel

Het doel is om de pI-waarde van verschillende eiwitten te bepalen.

2.

Principe

De scheiding van proteïnen via elektroforese is gebaseerd op hun lading. Wanneer een oplossing van proteïnen tussen twee elektroden wordt geplaatst en aan een spanningsbron wordt geschakeld. Dan zullen de negatieve proteïnen migreren naar de anode en de positieve naar de kathode. Hun lading hangt hoofdzakelijk af van hun pI-waarde en dus ook van de pH van het milieu waarin deze proteïnen zich bevinden.

·

Is pI groter dan pH: proteïnen zijn positief geladen

·

Is pI kleiner dan pH: proteïnen zijn negatief geladen

De snelheid waarmee de proteinen zullen migreren worden bepaald door:

·

hun afmetingen

·

hun vorm

·

hun ladingsdensiteit

Er zijn verschillende elketroforesetechnieken beschikbaar.
De elektroforesetechniek die we hier zullen toepassen is de isoelektrofocussing. Bij deze elktroforesetechniek wordt gewerkt met een pH-gradiënt die wordt aangebracht op de gel.

Een gel met pH-gradiënt wordt aangemaakt door een mengsel van carrier amfolyten die zich instellen volgens hun pI wanneer een elektrisch veld opgelegd wordt. Zo wordt een gel verkregen met verschillende bufferzones. Amfolyten zijn stoffen met een amfoteer karakter en een bufferende werking. Zij migreren onder invloed van een elektrisch veld tot de plaats die overeenstemt met hun pI-waarde waar ze een bufferde werking gaan uitvoeren.

Wanneer er nu proteïnen gespot worden in het midden van de gel en vervolgens aan een elektrisch veld onderworpen, dan migreren zij afhankelijk van hun lading(pI-waarde) naar de anode of de kathode. Als De proteïnen zullen blijven migreren totdat ze in een zone terecht komen waar de bufferende werking gelijk is aan hun pI-waarde. Als de proteïne deze zone heeft bereikt, dan zal de proteïne niet meer verder migreren. Op die manier worden de proteïnen gescheiden op basis van hun pI-waarde in zeer nauwe bandjes.

Aan de elektroden vinden zich de volgende reacties plaats:

·

aan de anode: 6 H2O O2 + 4 H3O+ + 4 e-

·

aan de kathode: 4 H2O + 4 e- 2 H2 + 4 OH-

De anode wordt zuur en de kathode basisch onder invloed van een elektrische stroom.

voordeel van isoelktrofocussing: Het effect van diffusie wordt vermeden door het feit dat we hier te maken hebben met een evenwichtstechniek. Met deze techniek wordt ook een zeer hoge resolutie bekomen.

3.

Werkwijze

We maken gebruik van het Phastsytem...








Nog geen opmerkingen of toevoegingen op dit document geplaatst.
Wil jij een bericht plaatsen dan kan dat door op "post message" te klikken.